rezonans magnetyczny warszawa nfz szpital praski

Leczenie hodowlanego nabłonka kombinacją EGF i TGF-a. inicjuje EMT (6), który jest związany z aktywacją markerów fibroblastów, takich jak FSP1, wimentyna i (3 -SMA oraz regulacja w dół E-kadheryn i białko zona occludens związane z ciasnym złączeniem (ZO-1); indukcja FSP1 poprzedza pojawienie się fenotypu EMT i zdolności nabłonka do ruchu, wskazując kluczową wczesną rolę FSP1. Podobna indukcja FSP1 w komórkach MCT / rCBF-A + (Figura 3D) sugeruje, że rCBF-A wystarcza do zainicjowania EMT. Następnie sprawdziliśmy poziomy ekspresji wielu innych markerów komórek nabłonkowych i fibroblastów w komórkach MCT / rCBF-A +, a także ich ruchliwość i morfologię. Wyniki z immunoblottingu wskazują, że komórki MCT / rCBF-A + mają podwyższone poziomy markerów fibroblastów FSP1, P-SMA, wimentyny i koloidu A (I), wraz z nowo zidentyfikowanymi markerami EMT, N-kadheryny, ślimaka i Twist (rysunek 3D). Te ostatnie 2 białka są czynnikami transkrypcyjnymi związanymi ze zwiększoną ruchliwością komórek nabłonka przejściowego (11, 20). Poziomy E-kadheryny, P-kateniny i ZO-1 zostały odpowiednio osłabione. Te zmiany poziomów białka wskazują na przebudowę komórek związaną z EMT (1, 2). Różnicowa ekspresja markerów nabłonka i fibroblastów indukowanych przez rCBF-A została potwierdzona przez zmiany w poziomach mRNA (dane nie pokazane) i immunobarwienie MCT / CBF-A + w porównaniu z kontrolnymi komórkami nabłonkowymi 5 dni po indukcji (Figura 4A). Wzór ekspresji i dystrybucji ZO-1, P-kateniny, P-SMA i wimentyny w komórkach MCT / CBF-A + wyraźnie wskazuje na zmianę fenotypu związanego z ekspresją FSP1. Ponadto, 5 dni po indukcji komórek rCBF-A, MCT / rCBF-A +, ale nie kontrolnych, przyjęto morfologię fibroblastów podobną do wrzeciona typową dla przejścia nabłonka (Figura 4B). Figura 4 Zasadnicza ekspresja rCBF-A w komórkach nabłonkowych MCT prowadzi do indukcji FSP1, zmian we wzorcu ekspresji markerów typu komórki i nabywania fenotypu mezenchymalnego. (A) Immunotrwałe z markerami typu komórek nabłonka naiwnego (MCT) i komórek eksprymujących rCBF-A. Uwzględniono wyniki barwienia za pomocą izotypu IgG (kontrola). Oryginalne powiększenie, × 630. (B) Zmiany morfologiczne w MCT / rCBF-A + w porównaniu z komórkami MCT w dniu 5 indukcji rCBF-A. Komórki są pokazane zarówno o wysokiej jak i niskiej gęstości. Oryginalne powiększenie, × 200. (C) Zwiększona ruchliwość komórek wyrażających rCBF-A (rCBF-A +) po indukcji doksycykliną w porównaniu z rCBFA. i kontrolować komórki MCT. Fibroblasty 3T3 włączono do tego testu w komorze Boydena jako kontrolę pozytywną. Średnia liczba migrujących komórek jest przedstawiona graficznie i oceniana statystycznie. Zmiana fenotypu indukowana przez rCBF-A była związana ze zwiększoną zdolnością fibroblastów MCT / rCBF-A + do migracji kierunkowo następującej po stymulacji surowicy w teście z komorą Boydena (Figura 4C). Odwrotnie, hamowanie ekspresji CBF-A w fibroblastach 3T3 przez siRNA powodowało skoordynowaną regulację w dół białek CBF-A i FSP1 (Figura 5). Transientowo transfekowany siRNA1 najlepiej hamował ekspresję CBF-A i FSP1 po 48 godzinach za pomocą qRT-PCR z 3 niezależnych doświadczeń; Odpowiednio 37% i 49% (P <0,001). Dane te łącznie wskazują, że nadekspresja rCBF-A w komórkach nabłonka prowadzi do utworzenia kompleksu FTS-1, ekspresji FSP1, modulacji genów nabłonkowych i fibroblastów, w tym ślimaków i twistów, a następnie EMT. Figura 5 Hamowanie transkryptów CBF-A przez siRNA ogranicza ekspresję transkryptów FSP1. Trzy syntetyczne rybonukleotydy transfekowano do fibroblastów 3T3, a działanie monitorowano za pomocą qRT-PCR w różnych punktach czasowych [podobne: malwa czarna, migotanie przedsionków leczenie, lamblia leczenie ]