przychodnia rogowscy w tczewie

Komórki mIMCD stymulowane do poddawania EMT z TGF-y / EGF tworzyły kompleksy FTS-1 w dniu 5 (dane nie pokazane). Kompleks wiążący FTS-1 (3 zidentyfikowany przez EMSA oczyszczono niezależnie, stosując chromatografię powinowactwa do DNA. Zastosowaliśmy biotynylowany tetramer z 25-par zasad FTS-1 przyłączonych do powlekanych streptawidyną kulek magnetycznych. Reakcje wiązania przeprowadzono w tych samych warunkach, co EMSA, aby zapewnić porównywalność. Początkowo stosowaliśmy 2 warianty eksperymentalne: bezpośrednią inkubację ekstraktów jądrowych z oligonukleotydem FTS-1; i podejście pośrednie z wykorzystaniem przepływu z początkowej inkubacji ze zmutowanym tetramerem do wtórnej inkubacji z tetramerem TTGAT. Białka, które wiążą się swoiście były wymywane z wysoką solą, z mocznikiem lub bez i analizowane przez EMSA przy użyciu znakowanego radioaktywnie FTS-1 typu dzikiego lub typu (Figura 1D). Wyniki tej analizy pokazują, że białka oczyszczone przez powinowactwo były zdolne do tworzenia kompleksu DNA-białko, który wędrował wraz z kompleksem 1. Nie było różnicy w kompleksach tworzonych przez białka oczyszczone przez oba podejścia, a następnie użyliśmy tylko podejście do minimalizowania zanieczyszczających białek. Wyniki te wykazały, że zarówno chromatografia powinowactwa EMSA, jak i DNA konsekwentnie identyfikują ten sam kompleks FTS-1. Kompleks odzyskany zarówno z EMSA, jak i z oczyszczania powinowactwa DNA zastosowano oddzielnie do identyfikacji białka wykorzystując tandemową spektrometrię mas (25). Analiza proteomiczna kompleksów FTS-1. Połączenie EMSA ze spektrometrią mas zidentyfikowało kilka sygnatur białek. Dwa niezależne peptydy z kompleksu FTS-1 (Tabela 1) zidentyfikowano jako CBF-A (26). Dwa inne peptydy należały do trójdzielnego białka motywu 28 (TIF1a / Trim28), mysiego homologa KAP-1 (27). Inne zidentyfikowane peptydy pochodziły z eukariotycznego czynnika wydłużania (1 (EEF1A1) i z czynnika replikacji DNA MCM3. Tabela Identyfikacja peptydu w kompleksie wiążącym FTS-1a Druga technika, chromatografia powinowactwa DNA, a następnie spektrometria mas, również zidentyfikowała CBF-A i KAP-1 w kompleksie FTS-1. Zidentyfikowano trzy niezależne peptydy CBF-A; 2 są dzielone przez oba podejścia do oczyszczania, a trzeci, EVYQQQQYGSGGR, pojawił się w kompleksie oczyszczonym przez powinowactwo (tabela 1). Opisane powyżej 2 peptydy KAP-1 również zostały potwierdzone. Jednakże, ani peptydy EEF1A1 ani MCM3 nie były obecne w kompleksie oczyszczonym przez powinowactwo. Zastosowaliśmy 2-wymiarowe EMSA / SDS-PAGE, a następnie immunoblot, aby dodatkowo scharakteryzować skład kompleksu FTS-1. W tym celu przeprowadziliśmy ekstrakty jądrowe w EMSA z inkubacją z sondą FTS-1 i bez niej, a następnie poddaliśmy kawałki żelu SDS-PAGE o drugim wymiarze. Po kolejnym przeniesieniu do błony i immunobarwieniu potwierdziliśmy obecność CBF-A i KAP-1 w kompleksie FTS-1 (Figura 2A). Immunobarwienie wykazało brak CBF-A i KAP-1 w ekstraktach kontrolnych, jak pokazano po lewej stronie każdego panelu. Tylko immunomodowanie dodatnie MCM3 wykryto po lewej stronie panelu (dane nie pokazane), co sugeruje, że to ostatnie białko nie tworzy kompleksu z FTS-1 i tylko wędruje z kompleksem w pierwszym wymiarze. Przeciwciało przeciwko EEF1A1 nie wykryło go ani w kompleksie, ani jako białko migrujące, co sugeruje, że był to artefakt. Rysunek 2CBF-A i KAP-1 są integralnymi częściami kompleksu FTS-1. (A) Immunoblot i elektroforeza 2D. Pierwszy wymiar: EMSA; drugi wymiar: SDS-PAGE. Po lewej: kontrola EMSA z białkiem jądrowym bez sondy; prawy (kompleks FTS-1): białko z sondą FTS-1. Brak immunobarwienia po lewej stronie wskazuje, że badane białka nie wędrują z kompleksami pod nieobecność DNA
[patrz też: migotanie przedsionków leczenie, leczo kalorie, mastocytoza ]