nurofen czopki cena

Udział CBF-A i KAP-1 w kompleksie FTS-1 został potwierdzony przez EMSA z ich przeciwciałami. Kompleks (*) został przesunięty w górę przez przeciwciało CBF-A jak wskazano (**) i został zniesiony przez przeciwciało anty-KAP-1; królicze IgG nie wpływało na kompleks. (C) ChIP chromatyny 3T3 z przeciwciałem anty-CBF-A lub króliczą surowicą odpornościową (.). Western blotting (górny panel): immunobloty sondowano przeciwciałami przeciwko KAP-1 i CBF-A; wybarwione IgG pokazano jako kontrolę obciążenia. PCR (dolny panel): rosnące ilości (2, 5 i 10 ul) DNA wymytego z immunoprecypitatów zastosowano jako matrycę w PCR ze starterami obejmującymi miejsce FTS-1 w obu kierunkach, wytwarzając fragment o wielkości około 280 pz. Genomowy DNA z fibroblastów 3T3 zastosowano w PCR jako kontrolę pozytywną. M, drabina wielkości DNA w kilobazach (kb). (D) Po indukcji EMT, komórki MCT wykazywały zwiększoną kolokalizację jądrową KAP-1 i CBF-A. Nabłonki MCT stymulowano przez 5 dni za pomocą TGF-y / EGF w hodowli. Komórki barwiono barwnikiem jodkowym propidium-czerwonym (czerwonym), a następnie pośrednią immunofluorescencję z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko CBF-A lub KAP-1 lub z kontrolnym anty-króliczym IgG FITC3. Oryginalne powiększenie, × 630. Wiązanie CBF-A i KAP-1 z sondą FTS-1 zostało dodatkowo potwierdzone przez supershiftami EMSA (rysunek 2B). Przeciwciało CBF-A supershifts kompleks FTS-1, podczas gdy przeciwciało przeciwko KAP-1 znosi go. Podejrzewamy, że przeciwciało KAP-1 najprawdopodobniej hamuje sterycznie interakcję CBF-A / KAP-1 z FTS-1. Anty-królicze IgG nie wpłynęły na ruchliwość lub integralność kompleksu FTS-1. Na koniec, przeprowadziliśmy test immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) z przeciwciałem CBF-A, stosując surowicę pre-immunizacyjną królika jako kontrolę negatywną. Western blot osadów (Figura 2C) potwierdziło obecność zarówno CBF-A, jak i KAP-1, jako uczestniczących w kompleksie z FTS-1. Zwiększoną ekspresję CBF-A i KAP-1 w jądrach komórkowych podczas EMT dodatkowo wykazano przez barwienie immunologiczne nabłonka MCT stymulowane TGF-a. i EGF w kulturze (6); Barwienie jądrowe CBF-A wzrosło z 14,8% komórek w niestymulowanym nabłonku do 47,9% w fibroblastach indukowanych przez EMT, a poziom jądrowego KAP-1 wzrósł z 3,3% do 30,2% (Figura 2D). Dane te łącznie sugerują, że CBF-A i KAP-1 są składnikami, które rozpoznają element FTS-1 w jądrach komórkowych. rCBF-A indukuje de novo ekspresję FSP1 w komórkach nabłonka nerki. Zróżnicowane komórki nabłonka nie eksprymują FSP1 ani nie tworzą kompleksów jądrowych z FTS-1 (24). Kiedy przechodzą one EMT, jednak tworzą kompleksy FTS-1 (rysunek 1C) i syntetyzują FSP1 (6). Aby zrozumieć funkcjonalne znaczenie CBF-A w indukcji FSP1, eksprymowaliśmy rekombinowany CBF-A (rCBF-A) w komórkach nabłonkowych. W tym celu linia komórkowa nabłonka nerki MCT była trwale transfekowana wektorem indukującym TET dla warunkowej ekspresji rCBF-A (MCT / rCBF-A). Wybraliśmy kilka klonów, które wykazywały kontrolowaną nadekspresję rCBF-A po ekspozycji na doksycyklinę. Odnosimy się do stanu nieindukowanego jako MCT / rCBF-A. i do stanu indukowanego doksycykliną jako MCT / rCBF-A +. Indukcja rCBF-A za pomocą doksycykliny doprowadziła do ekspresji transkryptów FSP1 (Figura 3A) i współrzędnych wyglądu białka FSP1 (Figura 3D). Nadekspresja rCBF-A spowodowała utworzenie kompleksu FTS-1, co potwierdzono testem ChIP z przeciwciałami CBF-A i KAP-1 (Figura 3B). Nieindukowane komórki utrzymują niski poziom endogennego CBF-A, a miejsca DNA FTS-1 nie można wykryć metodą PCR. Jednak komórki indukowane doksycykliną tworzyły kompleksy FTS-1 w sposób niezawodny (Figura 3B). Chromatyna z fibroblastów 3T3 była immunoprecypitowana równolegle jako kontrola pozytywna (Figura 3B po lewej), z porównywalnymi wynikami
[patrz też: mastocytoza, mięsak kości, kserostomia ]