Ponadto, ekstrakty jądrowe z komórek MCT / rCBF-A +, ale nie z komórek MCT typu dzikiego, tworzyły kompleks FTS-1 w EMSA z powinowactwem podobnym do ekstraktu z fibroblastów 3T3, jak wykazano przez prowokację ze wzrostem molarnych ilości nieznakowanych konkurent (rysunek 3C). Wyniki te wskazują, że nadekspresja rCBF-A prowadzi do tworzenia kompleksu FTS-1 i aktywacji ekspresji FSP1 w nabłonku w taki sam sposób, jak FSP1 ulega ekspresji przez fibroblasty. Figura 3 Nadekspresja CBF-A w komórkach nabłonkowych prowadzi do utworzenia kompleksu FTS-1 i ekspresji markerów fibroblastów. (A) Transkrypty dla wzrostu rCBF-A i FSP1 w cyklach PCR po indukcji rCBF-A. (B) Test ChIP pokazuje tworzenie kompleksu FTS-1 w komórkach nabłonka eksprymujących rCBF-A (+ Dox; doksycyklina) w porównaniu z komórkami 3T3. IgG było kontrolą ładowania. Immunoprecypitowane DNA zastosowano w PCR ze starterami dla FTS-1. (C) Białko jądrowe z fibroblastów MCT / rCBF-A + lub 3T3 tworzy kompleksy FTS-1 w EMSA o podobnym powinowactwie, poddane prowokacji przez 10-krotny lub 20-krotny molowy nadmiar nieznakowanej sondy FTS-1 (zimna sonda). Komórki MCT były kontrolą ujemną. (D) Różnicowa ekspresja markerów nabłonkowego i mezenchymalnego białka w komórkach MCT / rCBF-A + w różnych godzinach po indukcji rCBF-A w porównaniu z fibroblastami 3T3. Coo, barwienie Coomassie. (E) Zwiększona ekspresja CBF-A i FSP1 w UUO poddawanych EMT (odpowiednio 28% i 26%) mierzonej metodą qRT-PCR i przedstawiana graficznie w arbitralnych jednostkach. Do porównania dołączono E-kadherynę, a-SMA i KAP-1. (F) CBF-A (żółty / pomarańczowy) gromadzi się w jądrach komórek rurkowych i śródmiąższowych z nerki UUO u myszy FSP1.GFP. FSP1 + fibroblasty eksprymujące GFP pod kontrolą promotora FSP1 były ponownie ciemnoniebieskie, a jądra były wybarwione na czerwono. Normalna przeciwległa tkanka nerki demonstruje CBF-A w cytoplazmie rurkowej (nakrapiana na zielono). W cytoplazmie barwniki CBF-A i FSP1 łączą się, by stały się jasnoniebieskie. Oryginalne powiększenie, × 630. Potwierdziliśmy te odkrycia w modelu nerkowym in vivo EMT i zwłóknieniu po jednostronnej obturacji moczowodu (UUO) (4). Zatkane nerki poddawane EMT i zwłóknieniu po 12 dniach (dane nie pokazane) miały podwyższony poziom CBF-A, FSP1 i a-SMA (P <0,002; Figura 3E). Wzrostowi CBF-A i FSP1 towarzyszył spodziewany spadek ekspresji kadheryny. Ekspresja drugiego białka w kompleksie FTS-1, KAP-1, była nieznacznie podwyższona w nerce UUO, ale wzrost nie był statystycznie istotny. Figura 3F demonstruje zmianę lokalizacji jądrowej CBF-A we włóknistej tkance nerkowej 12 dni po UUO u myszy FSP1.GFP. CBF-A w normalnej przeciwległej nerce obserwowano w cytoplazmie (nakrapianym zielonym) komórek rurkowych (jądra zabarwione czerwienią jodkiem propidyny); FSP1 + fibroblasty eksprymujące GFP pod kontrolą promotora FSP1 przebarwiały się ciemnoniebiesko na tych obrazach. W ramkach oznaczonych UUO1 i UUO2 czerwone jądra stały się żółto-pomarańczowe ze zmianą lokalizacji CBF-A z cytoplazmy (procent wybarwionych jąder dla CBF-A wzrósł o 21% w zatkanych nerkach w porównaniu z 4% w kontrole kontralateralne ; P <0,0001), a fibroblasty zabarwiły się teraz na jasnoniebiesko z dodatkiem CBF-A. Ta seria obrazów sugeruje, że jądra wielu komórek rurkowych w nerce UUO są wzbogacone o CBF-A i potencjalnie pozycjonowane dla zdarzenia EMT. Regulacja w górę CBF-A w nerce UUO ustalona za pomocą ilościowej analizy PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) (Figura 3E) sugeruje, że większość białka jądrowego jest nowo syntetyzowana. Nadekspresja CBF-A angażuje transkryptom fibroblastów poprzez inicjowanie EMT [hasła pokrewne: mefedron cena, mielopatia szyjna, leniwe oko ]