julian dutka kraków

W naszym oryginalnym raporcie FTS-1 (24), używaliśmy oligonukleotydu o 100 pz z proksymalnego promotora FSP1 w celu identyfikacji kompleksu specyficznego dla fibroblastów przez EMSA. Aby zminimalizować tło, zapewniając jednocześnie swoistość wiązania z motywem 5-nukleotydowym FTS-1, tym razem wykorzystano sekwencję o 25 bp, zawierającą rdzeniowy pentanukleotyd (TTGAT) z sąsiednimi sekwencjami promotorowymi. Kompleksy zidentyfikowane przez EMSA przy użyciu zarówno oligonukleotydów jak i ekstraktów jądrowych fibroblastów miały podobną liczbę i wzór rozmieszczenia, gdy przebiegały równolegle (Figura 1A); różnice w względnej ruchliwości prążków wynikały z różnych długości oligonukleotydów. 4 kompleksy rywalizowano w różnym stopniu przez prowokację z sondą niewyznakowaną o 20-krotności molowej. Swoistość kompleksów utworzonych z oligonukleotydem FTS-1 o 25 pz dalej zbadano za pomocą analizy konkurencji z użyciem powiązanych i niespokrewnionych sond (Figura 1B). Kompleksy utworzone ze znakowanym radioaktywnie FTS-1 lub jego mutantem (CCAGC zamiast TTGAT) konkurowały w 20 x molarnym nadmiarze z nieznakowanymi gatunkami lub z miejscami konsensusowymi dla czynnika transkrypcyjnego Y-box (YB-1) i współczynnika odpowiedzi w surowicy (SRE). Sekwencja rdzeniowa YB-1 różni się nukleotydem od FTS-1 (TTGGT w porównaniu do TTGAT), a SRE nie jest związana z FTS-1 i zawiera motyw DNA z pola CarG. Zmutowane konstrukty tych oligonukleotydów również zastosowano w analizie konkurencji. Z 4 kompleksów utworzonych przez sondę FTS-1, wolno migrowany kompleks nie był rywalizowany przez jego mutanta i jedyny nie utworzony przez znakowanego radioaktywnie mutanta. Kompleks współzawodniczył z YB-1 ze względu na podobieństwo strukturalne, ale gdy był stosowany jako sonda, YB-1 nie tworzył podobnego kompleksu w EMSA (dane nie pokazane). Na kompleks nie wpłynęła również prowokacja mutantem YB-1 lub SRE. Analiza konkurencji potwierdziła ten kompleks jako specyficzny dla głównej strony FTS-1 (TTGAT). Nieznakowani konkurenci nie mieli wpływu na kompleks 4. Kompleksy 2 i 3, chociaż nie konkurowały z YB-1 lub SRE, zostały utworzone zarówno z FTS-1, jak i jego mutantem (Figura 1B). Dlatego tylko kompleks był specyficzny dla FTS-1. Kompleks także powstał w EMSA, gdy sonda była inkubowana z ekstraktami jądrowymi z komórek nabłonka nerki poddawanych EMT (Figura 1C) równolegle z ekspresją FSP1 (6). Figura 1: Identyfikacja i oczyszczanie kompleksu FTS-1 przez EMSA i chromatografię powinowactwa DNA. (A) Podobne kompleksy tworzą się w EMSA z białkiem jądrowym fibroblastów i sondami 25 pz lub 100 pz, obydwa zawierają pentanukleotyd rdzenia FTS-1. Kompleksy poddano prowokacji za pomocą nieznakowanych sond. (B) Specyfika kompleksu FTS-1 ustanowionego przez EMSA po przeprowadzeniu testu przez różnych nieoznakowanych konkurentów. Białko jądrowe Fibroblast inkubowano z radioznakowanym FTS-1 o 25 pz lub jego zmutowaną postacią (m). Kompleksy poddano prowokacji sondami DNA specyficznymi dla różnych miejsc regulatorowych. Kompleks właściwy dla pentanukleotydu TTGAT (oznaczony 1) znajduje się na szczycie; (m) wskazuje zmutowane oligonukleotydy. (C) Kompleks FTS-1 (oznaczony 1) jest utworzony przez komórki MCT indukowane do EMT, co udowodniono przez EMSA w różnych czasach po indukcji. Kompleks FTS-1 pochodzący od fibroblastów przedstawiono jako kontrolę pozytywną. (D) Białka oczyszczone metodą powinowactwa DNA tworzą tylko kompleks z FTS-1 (oznaczony 1) w EMSA. Frakcje oczyszczone metodą bezpośrednią lub pośrednią wymywano 0,5 M KCl, a następnie 0,5 M KCl plus 5 M mocznikiem, dializowano wobec 0,1 M KCl i inkubowano ze znakowanym radioaktywnie FTS-1 lub jego zmutowaną postacią (m). Przepływ (FT) z bezpośredniej inkubacji nie może utworzyć kompleksu FTS-1. Wyniki te potwierdzono w innej linii komórkowej nabłonka z mysiego wewnętrznego rdzenia zbierającego rdzenia (mIMCD;
[więcej w: mielopatia, leczo kalorie, łuszczyca stawowa ]