Ehrlichia ewingii, nowo rozpoznany agent ludzkiej erlichiozy ad

W niniejszym raporcie opisano charakterystykę kliniczną i laboratoryjną zakażenia E. ewingii oraz metody stosowane do identyfikacji infekcji u tych czterech pacjentów. Metody
Okazy
Próbki krwi potraktowane EDTA zebrano od 413 pacjentów z możliwą erlichiozą w okresie od 1994 do 1998. Leukocyty rozdzielono przez sedymentację dekstranem (masa cząsteczkowa, 500 000, T500, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) i przygotowano lizaty alkaliczne jak opisano wcześniej.13 DNA z 300 .l każdej próbki ekstrahowano zestawem krwi QIAamp (Qiagen, Valencia, CA) i ponownie zawieszono w 70 .l 10 mM buforu TRIS-EDTA.
Testy PCR
Zastosowano cztery diagnostyczne testy PCR ukierunkowane na gen rybosomalnego RNA 16S (rRNA): test szerokozakresowy zaprojektowany do amplifikacji wszystkich znanych gatunków ehrlichia i testów specyficznych dla E. chaffeensis, E. ewingii, i czynnik ludzkiej granulocytowej erlichiozy. Zastosowano następujące startery: ECA i HE3 w teście szerokozakresowym, 14,15 HE1 i HE3 w teście E. chaffeensis, 14 EHR 521 i EHR 747 w teście na czynnik ludzkiej granulocytowej erlichiozy, 16 i EWI i HE3 do testu E. ewingii.17 Dla każdego pacjenta przeprowadzono testy PCR na lizatach zawierających DNA z 105 leukocytów. Reakcje przeprowadzono w 100 .l próbek z termocyklerem DNA (model 480, Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Conn.). Końcowe stężenia mieszanin reakcyjnych i protokołów cyklicznych dla testu szerokozakresowego, testu swoistego dla E. chaffensis i testu swoistego dla E. ewingii oparto na modyfikacjach poprzednio opublikowanej procedury.
W teście szerokozakresowym, mieszanina reakcyjna zawierała 10 mM TRIS (pH 9,2), 75 mM chlorek potasu, 1,5 mM chlorek magnezu, 200 uM trifosforan 2 -deoksyadenozyny, 200 uM trifosforan deoksycytydyny, 200 uM trifosforan deoksyguanozyny, 200 uM deoksytymidynę. trifosforan, 15% glicerol, 40 pmoli każdego startera i 2,5 U polimerazy Taq. Następnie przeprowadzono amplifikację z 3 cyklami w 94 ° C przez minutę, 55 ° C przez 2 minuty i 70 ° C przez 1,5 minuty, następnie 37 cykli w 88 ° C przez minutę, 52 ° C przez 2 minuty, i 70 ° C przez 1,5 minuty.
W przypadku specyficznego testu E. chaffeensis i testu specyficznego dla E. ewingii, mieszanina reakcyjna składała się z 10 mM kwasu TRIS-chlorowodorowego (pH 8,8), 75 mM chlorku potasu, 1,5 mM chlorku magnezu, 200 .M trifosforanu 2 -deoksyadenozyny 200 .M trifosforanu deoksycytydyny, 200 .M trifosforanu deoksyguanozyny, 200 .M trifosforanu deoksytymidyny, 50 pmoli każdego startera, 5 procent formamidu i 2,5 U polimerazy Taq. Następnie przeprowadzono amplifikację zgodnie z tym samym protokołem, który zastosowano w teście szerokozakresowym, z tym wyjątkiem, że faza początkowa składała się z pięciu cykli w 94 ° C przez minutę, 60 ° C przez 2 minuty i 70 ° C przez 1,5 minuty. . Do oznaczenia czynnika ludzkiej granulocytowej erlichiozy wykorzystano końcową mieszaninę reakcyjną i warunki cykliczne opisane przez Pancholi i wsp. 16.
Sekwencjonowanie nukleotydów
Amplikony z testu PCR w szerokim zakresie dla ehrlichii sekwencjonowano przez dodanie 125 ng oczyszczonego amplikonu i 3,2 pmola startera do reakcji sekwencjonowania cyklicznego barwnika (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA) z DNA AmpliTaq FS. polimerazy
[więcej w: Leukocyturia, sklerodermia, teosyal ]
[podobne: lamblia leczenie, lamblia objawy, leczenie odleżyn ]