badania na osteoporozę poznań

Po trawieniu restrykcyjnym sekwencję subklonowano do wektora pcDNA5 / TO z indukowalnego tetracykliną T-REx (Invitrogen), wytwarzając wektor pcDNA5 / TO / rCBF-A. Komórki MCT transfekowano równocześnie z wektorem pcDNA5 / TO / rCBF-A i wektorem regulacyjnym pcDNA6 / TR układu T-REx, stosując odczynnik SuperFect (QIAGEN). Siedem mikrogramów plazmidu TR i 3 mg plazmidu rCBF-A zastosowano w celu zapewnienia większej liczby kopii czynnika regulatorowego. Po transfekcji komórki przełączono na pożywkę z surowicą wolną od tetracykliny (Clontech). Dwadzieścia cztery godziny po transfekcji rekombinowane komórki wybrano stosując 5 ug / ml blastycydyny (Invitrogen). Po utworzeniu kolonii komórki testowano na obecność obu wektorów przy użyciu starterów 5a -AGAGCTGCTTAATGAGGTCG-3. i 5. -GCATTATATGCACTCAGCGC-3. dla wektora TR; i 5. -TGTCAGTGGAAGCAAGTGTG-3. i 5. -ACTAGAAGGCACAGTCGAGG-3. (specyficzny BGH 3a -UTR) dla rCBF-A. Komórki traktowano .g / ml doksycykliny w celu indukcji rCBF-A i badano pod kątem zmian w ekspresji genów. Analiza PCR. Wszystkie primery były wytwarzane na zamówienie przez Invitrogen: FSP1: sensowny, 5a-ATGGCAAGACCCTTGGAGGA-3a, antysensowny, 5a-CATTGCACATCATGGCAATG-3a; GAPDH: sensowny, 5 (3 -GCAGTGGCAAAGTGGAGATT-3 (3, antysensowny, 5 (3 -GCAGAAGGGGCGGAGATGAT-3; rCBF-A: sensowny, 5a-TGTCAGTGGAAGCAAGTGTG-3; antysensowny, 5 -ACTAGAAGGCACAGTCGAGG-3. (pochodzące z BGH3a -UTR wektora). Przeprowadzono PCR z odwrotną transkrypcją, stosując 5 .g całkowitego RNA potraktowanego DNAse Iy z odwrotną transkryptazą SuperScript (Invitrogen). Podwielokrotności cDNA, 2 .g lub 0,2 .g, poddawano PCR przez 40 cykli, z usuniętymi 10 .l porcji w 20, 25, 30, 35 i 40 cyklach. Fragmenty rozdzielono na żelu agarozowym i zabarwiono bromkiem etydyny, a obrazy analizowano przy użyciu Scion Image (Scion Corp.). Do analizy qRT-PCR zebrano całkowite RNA w różnych punktach czasowych, potraktowano DNAzą I i przekształcono przez odwrotną transkrypcję. Startery / sondy dla CBF-A, FSP1 i GAPDH pochodziły z TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems). Oznaczenie ilościowe przeprowadzono w systemie PCR Real-Time Applied Biosystems 7900HT. inhibicja siRNA. Wstępnie zaprojektowane oligonukleotydy siRNA (Ambion) ukierunkowane na egzony 2 i 3 lub ekson 4 CBF-A / CBF-A. Te eksony nie podlegają alternatywnemu splicingowi. Każdy siRNA był oddzielnie transfekowany do fibroblastów 3T3 przy użyciu Lipofectamine 2000 (Invitrogen) zgodnie z instrukcją producenta dotyczącą transfekcji. SiRNA kontroli negatywnej (Ambion) transfekowano równolegle dla porównania. Poziomy CBF-A i ekspresji FSP1 monitorowano w różnych punktach czasowych po transfekcji za pomocą qRT-PCR, stosując ekstrahowane całkowite RNA i startery / sondy, jak opisano powyżej. Otrzymane wartości Ct normalizowano względem odpowiednich wartości Ct GAPDH. Wyniki z 3 oddzielnych eksperymentów zbadano pod kątem różnic statystycznych. siRNA3 został wybrany jako kontrola negatywna ze względu na brak wpływu na ekspresję CBF-A. Test ruchliwości. Migracja przez błonę w odpowiedzi na gradient w surowicy (test komorowy Boydena) przeprowadzono na 24-studzienkowych płytkach hodowlanych z insertami o wielkości porów 8 .m (BD). Komórki hodowano przez 5 dni z lub bez doksycykliny. Komórki (2 x 105) w 0,1% pożywce zawierającej BSA naniesiono na wierzch każdej z membran. Dolne studzienki zawierały 15% FBS. W razie potrzeby do obu dołków dodawano doksycyklinę. Płytki inkubowano przez 12 godzin w 37 ° C; membrany usunięto i wybarwiono barwnikiem Diff-Quik (IMEB). Komórki monitorowano w każdym polu za pomocą aparatu cyfrowego z obiektywem x 10 (DM IRB, Leica). Sześć pól na membranę zliczono w trzech powtórzeniach. Statystyka
[podobne: leczo kalorie, lewoskrętna witamina c, neostygmina ]