anuria and oliguria

Dane wyrażono w wartościach cyklu progowego (Ct) znormalizowanych względem odpowiadającej ekspresji GAPDH. Instytucjonalny komitet ds. Opieki nad zwierzętami (IACUC) na Uniwersytecie Vanderbilt zatwierdził wszystkie badania na zwierzętach. Immunohistochemia, immunofluorescencja i immunoblotting. Poliklonalne przeciwciało anty-KAP-1 zostało przygotowane przez Franka Rauschera (Wistar Institute, Philadelphia, Pennsylvania, USA); przeciwciało przeciw CBF-A zostało dostarczone przez Jonathana Dean, Imperial College of Science, Londyn, Wielka Brytania; przeciwciała anty-pan-kadheryna i przeciwciała anty-SMA pochodziły z Sigma-Aldrich; przeciwciała przeciwko kolagenowi I, wimentynie, twistowi, ślimakowi-1, N-kadherynie, ZO-1, P-kateninie i E-kadherynie pochodziły z Santa Cruz Biotechnology Inc. Immunohistochemię, immunofluorescencję i immunoblotting przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (13, 59). Jodek propidyny (0,1 .g / ml) (Molecular Probes, Invitrogen) i 1,0 × 10 8,8 M, sprzężone z TRITC, falloidyny (Sigma-Aldrich) zastosowano do barwienia jąder i aktów nitkowatych. Warianty izotypowe włączono jako kontrolę negatywną. Zmienność fluorescencji konfokalnej mierzono za pomocą programu NIH Image (http://rsb.info.nih.gov/nih-image). Analizę obrazu i danych przeprowadzono przy użyciu zasobów rdzeniowych Vanderbilt University Medical Center Cell Imaging. Żeton. Testy ChIP przeprowadzono przy użyciu odczynników z Upstate USA Inc. zgodnie z protokołem producenta z następującymi modyfikacjami. Sieciowanie formaldehydem (1% obj./obj.) Przeprowadzono bezpośrednio w hodowanych fibroblastach lub komórkach MCT / rCBF-A przez 10 minut w temperaturze 37 ° C i zakończono glicyną w końcowym stężeniu 0,125-M. Komórki przemyto dwukrotnie PBS zawierającym inhibitory proteinazy (1 mM PMSF, mg / ml aprotyniny i mg / ml pepstatyny A). Jądra uzyskano przy użyciu zestawu do oczyszczania jądrowego (NUC-101, Sigma-Aldrich) uzupełnionego tymi samymi inhibitorami proteinaz zgodnie z instrukcjami producenta. Dla każdego wariantu komórkowego, 3 próbki 106 jąder zawieszono ponownie w buforze do lizy SDS (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7,9) plus koktajl inhibitora proteazy dla tkanek ssaków (Sigma-Aldrich). Jądra zostały poddane działaniu ultradźwięków w celu uzyskania fragmentów DNA w zakresie od 0,1 do kb. Po odwirowaniu przy 10000 xg przez 10 minut w temperaturze 4 ° C, jedną część lizatu analizowano pod kątem wielkości fragmentu DNA po odwróceniu wiązań poprzecznych i oczyszczeniu. Pozostałe supernatanty rozcieńczono 10-krotnie buforem rozcieńczającym ChIP i inkubowano przez rotację z 80 .l 50% sparowanego agarozą kulek agarozowych DNA / białko łososia przez 90 minut w temperaturze 4 ° C. Perełki usunięto przez krótkie odwirowanie w 4 ° C i do lizatów dodano 10 .l surowicy odpornościowej królika lub króliczego przeciwciała CBF-A i inkubowano przez noc przez noc w 4 ° C. Próbki inkubowano następnie z 60 .l kulek agarozowych białka A przez godzinę w temperaturze 4 ° C, a perełki odzyskano przez krótkie odwirowanie i przemyto zgodnie z protokołem producenta: jeden raz buforem o niskiej zawartości soli 0,15 M NaCl, jeden raz z buforem o dużej zawartości soli 0,5 M NaCl i raz z 0,25 M roztworem płuczącym LiCl. Peletki przemyto jeden raz 10 mM Tris-HCl i mM EDTA, pH 8,0 (Tris-EDTA) i ponownie zawieszono. Próbki podzielono na 2, a kulki zebrano przez odwirowanie; jedną porcję ponownie zawieszono w buforze obciążającym SDS, gotowano przez 10 minut i załadowano na gotowy gotowy żel gradientowy 4%. 20% SDS (Bio-Rad) do analizy Western blot. Drugą część do analizy PCR ponownie zawieszono w Tris-EDTA plus 0,2 M NaCl i inkubowano przez noc w 65 ° C w celu odwrócenia wiązań sieciowych białko-DNA. Część tę wykorzystano bezpośrednio jako matrycę do analizy PCR ze starterami wytwarzającymi fragment o około 280 bp obejmujący miejsce FTS-1 w obu kierunkach; niestandardowe startery FTS-1 (Invitrogen) były: 5 (3-GGTGGTAGATATTCTGCTCC-3. i 3a-TCTGCAACAACTCCTTGAGC-5 .. EMSA
[hasła pokrewne: łupież tłusty, neostygmina, migotanie przedsionków leczenie ]